sábado, 10 de maio de 2014

Análise de β-ecdisona em plantas in vivo e in vitro de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, através da Cromatografia em Camada Delgada



Análise de β-ecdisona em plantas in vivo e in vitro de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, através da Cromatografia em Camada Delgada                                                                                                                                                                                MATERIAL E MÉTODO
Utilizaram-se dois acessos (BRA e JB-UFSM) de P. glomerata (Spreng.) Pedersen, sendo o acesso BRA coletado no município de Querência do Norte, PR e o acesso JB-UFSM coletado no Jardim Botânico da UFSM, Santa Maria, RS. Uma exsicata desta espécie encontra-se depositada no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM (SMDB 7606).
Segmentos nodais (1 cm) de ambos os acessos foram desinfestados e cultivados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com sacarose (30 g L-1), mio-inositol (100 mg L-1) e ágar (6 g L-1) (Nicoloso et al., 2001). O pH foi ajustado para 5,9. As plantas foram cultivadas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2ºC, 16 horas de fotoperíodo e 35 mM m-2 s-1 de luminosidade. Após 30 dias de cultivo, as plantas foram aclimatizadas e transferidas para condições de cultivo em solo, no município de São Pedro do Sul, RS, Brasil.
A presença da β-ecdisona  foi analisada nas raízes e partes aéreas das plantas in vitro(30 dias de idade), bem como, nas plantas transferidas para o campo (in vivo), as quais foram coletadas, durante a primavera, dois anos após o plantio no solo. O material vegetal foi seco em estufa a 50ºC (Simões et al., 2001) e triturado em gral. As amostras (200 mg) foram extraídas com metanol (2 vezes, 5 mL) em banho ultra-sônico, durante 20 minutos. O sobrenadante foi removido após centrifugação a 1000 g durante 10 minutos e os extratos obtidos das duas extrações foram combinados (10 mL) (Flores, 2006).
        RESULTADO E DISCUSSÃO
As análises cromatográficas das amostras das plantas in vivo dos acessos de P. glomerata (Spreng) Pedersen mostraram a presença de β-ecdisona tanto nas raízes como na parte aérea das plantas. A mancha correspondente à β-ecdisona apresentou Rf=0,7 e coloração esverdeada, o que a diferenciou das demais manchas observadas na placa cromatográfica.
Recentemente, devido à importância das raízes do ginseng brasileiro para a fabricação de fitoterápicos, a presença e o doseamento de β-ecdisona vêm sendo muito estudados (Flores, 2006), porém as pesquisas estão limitadas ao sistema radicular da planta (Magalhães, 2000; Vigo et al., 2004). Contudo, os resultados obtidos neste estudo mostraram que a parte aérea de P. glomerata também contém β-ecdisona, além de vários outros metabólitos, cujas manchas não foram detectadas nas raízes . De fato, várias pesquisas vêm demonstrando que os fitoecdisteróides podem ser biossintetizados e/ou acumulados em diferentes órgãos das plantas. Em Pfaffia iresinoides, estudos sobre o teor órgão-específico de ecdisteróides mostraram que a β-ecdisona estava presente tanto nas raízes como no caule e folhas desta espécie (Nishimoto et al., 1987), o que concorda com os resultados obtidos neste estudo.
Por outro lado, manchas correspondentes à β-ecdisona não foram detectadas nos extratos metanólicos das raízes e partes aéreas das plantas in vitro, em ambos os acessos estudados . Apesar de estas amostras apresentarem manchas com Rf muito similar àquele do padrão de β-ecdisona , a co-cromatografia mostrou que as manchas detectadas nas plantas in vitro não se tratavam da β-ecdisona, pois aquelas apresentavam coloração diferente quando comparada à mancha da β-ecdisona. Ao contrário, estudos conduzidos com plantas in vitro Ajuga evidenciaram um alto teor de fitoecdisteróides (Tomás et al., 1993). Contudo, é importante salientar que é muito difícil comparar a produção de determinado metabólito produzido a partir de células e/ou tecidos in vitro, com aqueles produzidos nos tecidos de plantas completas, cultivadas a campo. Neste estudo, a não detecção da β-ecdisona nas plantas in vitro pode ser devido a pouca diferenciação dos tecidos e órgãos, além do reduzido tempo de cultivo in vitro (30 dias), quando comparado às plantas cultivadas a campo, as quais apresentavam dois anos de idade. A diferenciação dos tecidos, a idade da planta e as condições do meio ambiente são importantes fatores que afetam a produção de metabólitos secundários.
Constatou-se que os perfis cromatográficos das amostras in vivo e in vitro do acesso JB-UFSM  foram similares as do acesso BRA . Estes resultados demonstram que, apesar da P. glomerata apresentar grande variabilidade genética e morfológica (Magalhães, 2000), os acessos estudados neste trabalho não apresentaram diferenças marcantes em relação à composição química. O padrão geral das manchas, bem como o Rf e a coloração da mancha correspondente à β-ecdisona obtidos neste estudo, com as plantas in vivo, foram similares aos encontrados por Vigo et al. (2004), em amostras de raízes de P. glomerata.
Apesar de a β-ecdisona não ter sido detectada nas amostras in vitro, a comparação dos perfis cromatográficos das partes aéreas das plantas in vivo e in vitro, mostrou que as últimas apresentam um maior número de manchas  quando comparado às plantas coletadas a campo (in vivo) . Várias pesquisas têm mostrado que as condições impostas durante o cultivo in vitro podem influenciar na biossíntese e/ou acúmulo de diferentes metabólitos, inclusive de ecdisteróides (Tomás et al., 1993).
O sistema cromatográfico adotado neste estudo mostrou-se como uma alternativa viável para a detecção rápida de â-ecdisona em amostras de ginseng brasileiro. A obtenção de um perfil cromatográfico de amostras de raízes de diferentes acessos de P. glomerata mostra-se útil para o controle da qualidade da matéria-prima, principalmente na avaliação da estabilidade das drogas ou extratos derivados. Além disso, Vigo et al. (2004) ressaltaram a importância da CCD na avaliação da pureza e da autenticidade de diferentes drogas comercializadas como sendo provenientes de raízes P. glomerata.
Apesar de a CCD ser uma ferramenta muito útil para a identificação rápida de compostos de interesse em uma amostra, neste estudo, esta técnica mostrou-se pouco sensível para a análise de β-ecdisona em amostras de plantas cultivadas in vitro. A metodologia de CCD adotada mostrou-se adequada apenas para a detecção de β-ecdisona quando em concentração igual ou superior a 25 mg mL-1. Desta forma, a não visualização da mancha referente à β-ecdisona nas plantas in vitro pode ser devido a ausência do composto no material, pela presença da Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio financeiro e a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF, Brasil) pelo fornecimento do acesso BRA de Pfaffia glomerata.
CONCLUSÃO
Os resultados permitiram concluir que: a) a CCD é técnica viável para a detecção de β-ecdisona nas raízes e partes aéreas de plantas in vivo de P. glomerata; b) os acessos BRA e JB-UFSM não apresentam diferenças marcantes em relação ao perfil     de bandas cromatográficas e c) a análise em CCD não detecta β-ecdisona em plantas in vitro.
Fonte:Rev. bras. plantas med. vol.11 no.4 Botucatu  2009
    postado por:Hélcio Sampaio                                                          

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