Análise de β-ecdisona em plantas in vivo e in vitro de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, através da Cromatografia em Camada Delgada MATERIAL E MÉTODO
Utilizaram-se
dois acessos (BRA e JB-UFSM) de P. glomerata (Spreng.) Pedersen, sendo o
acesso BRA coletado no município de Querência do Norte, PR e o acesso JB-UFSM
coletado no Jardim Botânico da UFSM, Santa Maria, RS. Uma exsicata desta
espécie encontra-se depositada no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM
(SMDB 7606).
Segmentos
nodais (1 cm) de ambos os acessos foram desinfestados e cultivados em meio MS
(Murashige & Skoog, 1962), suplementado com sacarose (30 g L-1),
mio-inositol (100 mg L-1) e ágar (6 g L-1) (Nicoloso et
al., 2001). O pH foi ajustado para 5,9. As plantas foram cultivadas em sala de
crescimento com temperatura de 25 ± 2ºC, 16 horas de fotoperíodo e 35 mM m-2
s-1 de luminosidade. Após 30 dias de cultivo, as plantas foram
aclimatizadas e transferidas para condições de cultivo em solo, no município de
São Pedro do Sul, RS, Brasil.
A presença
da β-ecdisona
foi analisada nas raízes e partes aéreas
das plantas in vitro(30 dias de idade), bem como, nas plantas
transferidas para o campo (in vivo), as quais foram coletadas, durante a
primavera, dois anos após o plantio no solo. O material vegetal foi seco em
estufa a 50ºC (Simões et al., 2001) e triturado em gral. As amostras (200 mg)
foram extraídas com metanol (2 vezes, 5 mL) em banho ultra-sônico, durante 20
minutos. O sobrenadante foi removido após centrifugação a 1000 g durante 10
minutos e os extratos obtidos das duas extrações foram combinados (10 mL)
(Flores, 2006).
RESULTADO E DISCUSSÃO
As
análises cromatográficas das amostras das plantas in vivo dos acessos de
P. glomerata (Spreng) Pedersen mostraram a presença de β-ecdisona tanto nas
raízes como na parte aérea das plantas. A mancha correspondente à β-ecdisona
apresentou Rf=0,7 e coloração esverdeada, o que a diferenciou das demais
manchas observadas na placa cromatográfica.
Recentemente,
devido à importância das raízes do ginseng brasileiro para a fabricação de
fitoterápicos, a presença e o doseamento de β-ecdisona vêm sendo muito estudados
(Flores, 2006), porém as pesquisas estão limitadas ao sistema radicular da
planta (Magalhães, 2000; Vigo et al., 2004). Contudo, os resultados obtidos
neste estudo mostraram que a parte aérea de P. glomerata também contém β-ecdisona, além de
vários outros metabólitos, cujas manchas não foram detectadas nas raízes . De
fato, várias pesquisas vêm demonstrando que os fitoecdisteróides podem ser
biossintetizados e/ou acumulados em diferentes órgãos das plantas. Em Pfaffia
iresinoides, estudos sobre o teor órgão-específico de ecdisteróides
mostraram que a β-ecdisona
estava presente tanto nas raízes como no caule e folhas desta espécie
(Nishimoto et al., 1987), o que concorda com os resultados obtidos neste
estudo.
Por outro
lado, manchas correspondentes à β-ecdisona não foram detectadas nos extratos
metanólicos das raízes e partes aéreas das plantas in vitro, em ambos os
acessos estudados . Apesar de estas amostras apresentarem manchas com Rf muito
similar àquele do padrão de β-ecdisona , a co-cromatografia mostrou que as manchas
detectadas nas plantas in vitro não se tratavam da β-ecdisona, pois
aquelas apresentavam coloração diferente quando comparada à mancha da β-ecdisona. Ao
contrário, estudos conduzidos com plantas in vitro Ajuga evidenciaram um
alto teor de fitoecdisteróides (Tomás et al., 1993). Contudo, é importante
salientar que é muito difícil comparar a produção de determinado metabólito
produzido a partir de células e/ou tecidos in vitro, com aqueles
produzidos nos tecidos de plantas completas, cultivadas a campo. Neste estudo,
a não detecção da β-ecdisona
nas plantas in vitro pode ser devido a pouca diferenciação dos tecidos e
órgãos, além do reduzido tempo de cultivo in vitro (30 dias), quando
comparado às plantas cultivadas a campo, as quais apresentavam dois anos de
idade. A diferenciação dos tecidos, a idade da planta e as condições do meio
ambiente são importantes fatores que afetam a produção de metabólitos
secundários.
Constatou-se
que os perfis cromatográficos das amostras in vivo e in vitro do
acesso JB-UFSM foram similares as do
acesso BRA . Estes resultados demonstram que, apesar da P. glomerata
apresentar grande variabilidade genética e morfológica (Magalhães, 2000), os
acessos estudados neste trabalho não apresentaram diferenças marcantes em relação
à composição química. O padrão geral das manchas, bem como o Rf e a coloração
da mancha correspondente à β-ecdisona obtidos neste estudo, com as plantas in
vivo, foram similares aos encontrados por Vigo et al. (2004), em amostras
de raízes de P. glomerata.
Apesar de
a β-ecdisona
não ter sido detectada nas amostras in vitro, a comparação dos perfis
cromatográficos das partes aéreas das plantas in vivo e in vitro,
mostrou que as últimas apresentam um maior número de manchas quando comparado às plantas coletadas a campo
(in vivo) . Várias pesquisas têm mostrado que as condições impostas
durante o cultivo in vitro podem influenciar na biossíntese e/ou acúmulo
de diferentes metabólitos, inclusive de ecdisteróides (Tomás et al., 1993).
O sistema
cromatográfico adotado neste estudo mostrou-se como uma alternativa viável para
a detecção rápida de â-ecdisona em amostras de ginseng brasileiro. A obtenção
de um perfil cromatográfico de amostras de raízes de diferentes acessos de P.
glomerata mostra-se útil para o controle da qualidade da matéria-prima,
principalmente na avaliação da estabilidade das drogas ou extratos derivados.
Além disso, Vigo et al. (2004) ressaltaram a importância da CCD na avaliação da
pureza e da autenticidade de diferentes drogas comercializadas como sendo
provenientes de raízes P. glomerata.
Apesar de
a CCD ser uma ferramenta muito útil para a identificação rápida de compostos de
interesse em uma amostra, neste estudo, esta técnica mostrou-se pouco sensível
para a análise de β-ecdisona
em amostras de plantas cultivadas in vitro. A metodologia de CCD adotada
mostrou-se adequada apenas para a detecção de β-ecdisona quando em concentração
igual ou superior a 25 mg mL-1. Desta forma, a não visualização da
mancha referente à β-ecdisona
nas plantas in vitro pode ser devido a ausência do composto no material,
pela presença da Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
auxílio financeiro e a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília,
DF, Brasil) pelo fornecimento do acesso BRA de Pfaffia glomerata.
CONCLUSÃO
Os
resultados permitiram concluir que: a) a CCD é técnica viável para a detecção
de β-ecdisona
nas raízes e partes aéreas de plantas in vivo de P. glomerata; b)
os acessos BRA e JB-UFSM não apresentam diferenças marcantes em relação ao
perfil de bandas cromatográficas e c)
a análise em CCD não detecta β-ecdisona em plantas in vitro.
Fonte:Rev. bras. plantas
med. vol.11 no.4 Botucatu 2009
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