quarta-feira, 28 de maio de 2014

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA O DIAGNÓSTICO DA INTOXICAÇÃO POR ALDICARB ("CHUMBINHO") EM CÃES E GATOS.


          Praguicidas são os principais responsáveis por intoxicações, tanto em seres humanos como em animais. Investigações sugerem que o uso ilegal do praguicida carbamato aldicarb (‘chumbinho”), tendo a finalidade de intoxicar cães e gatos, vem ocorrendo com frequência na cidade de São Paulo, assim como em outras cidades que possuem grande numero de animais de rua.
        A cromatografia em camada delgada foi capaz de identificar a presença desse praguicida em absolutamente todas as amostras do conteúdo estomacal que foi colhido dos animais intoxicados por aldicarb, mostrando que essa é uma técnica qualitativa muito eficiente e adequada para esse tipo de caso, além de ser relativamente rápida, com baixo custo e não sofrer interferência de componentes da matriz. Essa técnica foi útil também na identificação desse agente em outros tipos de amostras, como alimentos e iscas.

Referência:
XAVIER, F.G. et al . Cromatografia em camada delgada para o diagnóstico da intoxicação por aldicarb ("chumbinho") em cães e gatos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 59, n. 5, Oct. 2007 . 
Available from<http://www.scielo.br/scielo.phpscript=sci_arttext&pid=S010209352007000500020&lng=en&nrm=iso>. access on 07 Apr. 2011. doi: 10.1590/S0102-09352007000500020. 

Fonte: http://toxicoforensenoite.blogspot.com.br/2011/04/cromatografia-em-camada-delgada-para-o.html

Postado por RENATA BARBOSA RODRIGUES

terça-feira, 27 de maio de 2014

ANÁLISE DE EXTRATOS DE PLANTAS POR CCD: UMA METODOLOGIA APLICADA À DISCIPLINA “QUÍMICA ORGÂNICA”


Mariana H. Chaves
Universidade Federal do Piauí - Departamento de Química - Ininga - 64049 - 550 - Teresina - PI

Recebido em 31/10/96; aceito em 20/1/97

INTRODUÇÃO
O tópico “análise de misturas” é abordado normalmente, a partir de uma mistura hipotética ou na prática a partir de uma mistura artificial preparada com substâncias puras. O método geral comumente empregado na análise consiste em separar os componentes e identificá-los posteriormente utilizando reações de classe. Vale ressaltar que torna-se impossível apresentar em um livro texto uma gama de processos que sejam aplicáveis sem modificação à grande variedade de combinações de misturas que podem ser fornecidas. A falta de mais livros textos e a dificuldade de aquisição dos existentes pelos alunos levou ao desenvolvimento de uma metodologia para o estudo de análise de misturas na disciplina Química Orgânica III. O programa desta disciplina no currículo de Bacharelado e Licenciatura em Química da Universidade Federal do Piauí inclui o estudo dos tópicos: análise de misturas, critérios de pureza e o uso da espectrometria no UV, IV, RMN e massas na identificação de estruturas de substâncias orgânicas. Neste curso o tópico “análise de misturas” foi abordado utilizando-se como exemplo extratos de plantas regionais.
Inicialmente, duas espécies vegetais de distribuição ampla no Estado do Piauí foram escolhidas para estudo: Annona squamosa (ata) e Annona muricata (graviola), ambas pertencentes à família Annonaceae e com estudos fitoquímicos já relatados na literatura. Escolheu-se para análise espécies desta família em função de serem ricas em metabólitos pertencentes aos vários grupos fitoquímicos, pois o ojetivo, além da aplicação da extração líquido-líquido, foi a obtenção de um perfil cromatográfico em camada delgada de sílica dos diversos extratos visando a investigação de carboidratos, ácidos aminados, alcalóides, flavonóides e terpenóides.
EXPERIMENTAL
Procedimentos Experimentais Gerais: As placas cromatográficas foram preparadas utilizando camadas de 0,25 mm de uma mistura (25 g) de 3:1 de sílica gel 60 (artigo 7731) e sílica PF254+366 (artigo 7748), ambas da Merck, suspensa em aproximadamente 50 mL de água. A solução de sulfato cérico foi preparada a partir de 2,1 g de Ce(SO4)2.5H2O dissolvido em 15 mL de H2SO4 concentrado e adicionado a 800 mL de água. O reagente Dragendorf foi preparado a partir de 0,85 g de nitrato de bismuto Bi(NO3)3.4H2O dissolvido em 40 mL de H2O e 10 mL de ácido acético glacial, seguido por adição de 8 g de iodeto de potássio dissolvido em 20 mL de água. A solução de ninidrina foi preparada a partir 30 mg de ninidrina (C9H6O4), dissolvida em 10 mL de n-butanol, seguido por adição de 0,3 mL de ácido acético glacial. A solução de anisaldeído foi preparada pela adição de 0,5 mL de anisaldeído (C8H8O2) em 9 mL de etanol (95%), 0,5 mL de H2SO4 concentrado e 0,1 mL de ácido acético glacial. As placas borrifadas com solução de sulfato cérico, ninidrina ou anisaldeído foram aquecidas por 5-10 minutos.
Material Vegetal: Folhas de ata (Annona squamosa) foram coletadas no bairro Monte Castelo
Teresina-PI e folhas de graviola (Annona muricata) no sítio Recreio, Br 316, Km 22, Teresina-PI. As exsicatas destes espécimens encontram-se depositadas no Herbário Graziela Barroso com os números 9482 e 9435 respectivamente e foram identificadas pelos professores: Airan Silva Lopes e Francisco Maurício Teles Freire.
Descrição da Metodologia: Para execução da metodologia proposta, a turma foi dividida em quatro equipes constituídas cada uma por no máximo três alunos. Duas equipes, uma com folhas de graviola e a outra com folhas de ata seguiram o esquema 1 e as outras duas o esquema 2.
As equipes que trabalharam seguindo o esquema 1 tiveram como objetivo obter para as duas espécies, um perfil cromatográfico do extrato etanólico e das frações decorrentes deste após extração líquido-líquido, enquanto que o objetivo das equipes que procederam segundo o esquema 2 foi a aplicação da extração com solventes quimicamente ativos na obtenção de alcalóides, bem como a obtenção do perfil cromatográfico das fases alcaloídicas e orgânicas neutras decorrentes desta extração.
Os extratos obtidos mediante esquema 1 foram concentrados, pesados e analisados por cromatografia em camada delgada comparativa de sílica utilizando os seguintes sistemas de solventes: hexano/acetato de etila (8:2), clorofórmio/metanol/ hidróxido de amônio (95:5:0,5) e clorofórmio/metanol/água (65:30:5). As placas foram  reveladas com solução de sulfato cérico para investigação de substância de natureza terpenoídica e flavonoídica e com reagente Dragendorf para investigação de alcalóides. As fases butanólica e aquosa foram ainda submetidas a cromatografia comparativa em placa de sílica eluída com clorofórmio/metanol/água (5:4:1) e aquosa foram ainda submetidas a cromatografia comparativa em placa de sílica eluída com clorofórmio/metanol/água (5:4:1) e revelada com ninidrina para investigação de ácidos aminados e, com n-butanol/ácido acético/éter etílico/água (9:6:3:1) revelada com anisaldeído, para investigação de carboidratos.
Os extratos obtidos mediante esquema 2 foram concentrados, pesados e analisados por cromatografia em camada delgada comparativa de sílica. As placas realizadas com o extrato bruto e fases alcaloídicas foram eluídas com clorofórmio/metanol/hidróxido de amônio (95:5:0,5) e como reveladores foi usado irradiação UV (254 e 356 nm) e reagente Dragendorf para investigação de alcalóides. O extrato bruto e as fases orgânicas neutras (material graxo, metanólica e acetato de etila) foram ainda submetidas a cromatografia comparativa em placas de sílica eluídas com hexano/acetato de etila (8:2), e clorofórmio/metanol/água (65:30:5) reveladas com solução de sulfato cérico para investigação de substâncias de natureza terpenoídicas e flavonoídicas respectivamente.

RESULTADOS
Os resultados obtidos pelos alunos foram apresentados através de relatórios e expostos na forma de painéis a fim de possibilitar maior discussão entre os grupos. As equipes que trabalharam seguindo o esquema 1 observaram que o extrato bruto, fase metanólica e, em intensidade menor, o material graxo apresentaram manchas rósea e azul em placa eluída com hexano/acetato de etila (8:2) e revelada com solução de sulfato cérico. Isto sugeriu a presença de substâncias de natureza terpenoídica. Ao compararem os resultados da placa com estes extratos versus o padrão da mistura dos esteróides distribuídos amplamente na natureza (estigmasterol e sitosterol) utilizando o mesmo sistema de solventes constataram que estas substâncias estão presentes na ata porém não na graviola. Observaram, também, que as fases acetato de etila, butanólica e aquosa apresentaram manchas amarelas e cinzas em placa eluída com clorofórmio/MeOH/água (65:30:5) e revelada com solução de sulfato cérico. A cor cinza sugeriu a presença de açúcares e a amarela de flavonóides. A presença de açúcares foi confirmada por eluição de placa destes extratos em n-butanol/ácido acético/ éter etílico/água (9:6:3:1) e revelação com solução de anisaldeído. Entre as cores observadas, a azul (Rf~0,47) e verde (Rf~0,55) sugeriram a presença de ribose e ranminose respectivamente. Observaram ainda que a fase aquosa e em extensão menor, a fase butanólica apresentaram manchas púrpura e amarela em placa eluída com clorofórmio/MeOH/água (5:4:1) e reveladas com solução de ninidrina. O aparecimento destas cores é indicativo da presença de ácidos aminados, sendo que a cor amarela deve ser relativa à prolina conforme padrão utilizado. Finalmente observaram que as fases acetato de etila e butanólica apresentaram manchas alaranjadas em placa eluída com clorofórmio/MeOH/NH4OH (95:5:0,5) e revelada com reagente Dragendorf, sugerindo a presença de alcalóides.
As equipes que trabalharam seguindo o esquema 2 observaram que as fase alcaloídicas apresentaram manchas alaranjadas em placas eluídas com clorofórmio/MeOH/NH4OH (95:5:0,5) e reveladas com reagente Dragendorf confirmando a presença de alcalóides. Ao utilizarem o padrão da liriodenina, um alcalóide oxoaporfínico distribuído amplamente em plantas da família Annonaceae e facilmente identificado pela coloração e fluorescência amarela intensa apresentada em placas reveladas no visível e ultravioleta respectivamente, foi possivel evidenciálo apenas na ata. Observaram também, que a fase orgânica neutra (acetato de etila) apresentou manchas amarela e cinza quando eluída com clorofórmio/MeOH/água (65:30:5) e reveladas com solução de sulfato cérico, sugerindo a presença de flavonóides e carboidratos respectivamente. Evidenciaram também a presença de substâncias de natureza terpenoídicas quando as placas realizadas com as fases orgânicas neutras (material graxo e fase metanólica) foram eluídas com hexano/acetato de etila (8:2) e reveladas com solução de sulfato cérico. Confirmaram inclusive os resultados observados pelas equipes que trabalharam seguindo o esquema 1 no que se referiu à presença da mistura de estigmasterol e sitosterol somente na ata. Estes resultados estão consistentes com os dados relatados na literatura relativos à fitoquímica de Annonaceae.

CONCLUSÃO
A metodologia desenvolvida mostrou-se bastante eficiente, uma vez que possibilitou ao aluno adquirir familiaridade com as técnicas de extração líquido-líquido com solventes reativos e não reativos e com a cromatografia em camada delgada. Além disso, forneceu informações sobre a polaridade das substâncias existentes nos diversos extratos, bem como sobre a constituição química da planta. Finalmente, a metodologia desenvolvida, além de incentivar os alunos para iniciação científica, forneceu uma boa base para aqueles que pretendem trabalhar na área de produtos naturais.







Fonte: QUÍMICA NOVA, 20(5) (1997)


Postado por: Thamiris montenegro

segunda-feira, 26 de maio de 2014

ÓLEO ESSENCIAL DE LIMÃO NO ENSINO DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Rosaly S. Silva, Carlos Magno R. Ribeiro, Márcia N. Borges e Giselle S. O. Blois


INTRODUÇÃO

A cromatografia em camada delgada (CCD) é um tema importante abordado nos cursos de graduação em química e áreas afins, principal­mente no ensino de química orgânica experimental. É uma técnica sim­ples e de execução relativamente rápida.
Devido à composição química do óleo essencial obtido de cascas de limão, que consiste principalmente de monoterpenoides, com uma razoável diversidade de grupos funcionais, é possível, em apenas uma aula experimental, abordar a cromatografia em camada delgada sob diferentes aspectos, tais como poder de eluição e poder de resolução de solventes, reveladores versus estrutura química e fator de retenção versus estrutura química.
A experiência consiste na cromatografia em camada delgada do óleo essencial de limão, em dois sistemas diferentes de eluição e na visualização do cromatograma em cinco sistemas diferentes de revelação. O óleo essencial de limão pode ser obtido rapidamente através da compressão manual de cascas de limão no início da aula experimental, ou por meio da destilação por arraste a vapor de cascas de limão seguidas por extração líquido-líquido, realizadas em uma ou duas aulas anteriores sobre estas técnicas.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos gerais

Foram utilizados limões taiti, solventes PA Vetec foram utilizados e usados diretamente dos frascos. Foram utilizadas cromatofolhas F254, Lâmpada de UV, munida com luz ultravioleta de comprimentos de ondas longo e curto, foi utilizada como revelador, colocando-se as placas cromatográficas sob a incidência de sua luz em caixas escuras adequadas. Soluções de vanilina sulfúrica12 e de 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNFH), preparadas através de metodologia usual, foram utilizadas como reveladores. A aplicação das soluções reveladoras nas placas croma­tográficas foi realizada com o uso de pipeta Pasteur, que foi passada horizontalmente ao longo de cada placa. A revelação com iodo foi efetuada colocando-se as placas em cubas de vidro devidamente fechadas contendo cristais de iodo. Na aplicação em aula, sugere-se que os procedimentos descritos sejam realizados por equipe de dois alunos e que as soluções revela­doras sejam preparadas antes da aula de CCD.

Extração de óleo por ação mecânica

Dois limões são descascados cuidadosamente de modo a não permitir a presença de bagaço e suco. As cascas dos limões são ma­nualmente espremidas pela parte externa, obtendo-se algumas gotas de um óleo que são coletadas em um tudo de ensaio de 10 mL de capacidade munido com um funil simples de 5 cm de diâmetro. Em seguida, o funil é lavado com 2 mL de diclorometano para o interior do tubo de ensaio (podendo ser utilizado acetato de etila como al­ternativa), obtendo-se assim o extrato pronto para ser aplicado nas placas cromatográficas.

Extração de óleo por arraste a vapor

O procedimento de extração descrito a seguir é alternativo e deve ser utilizado no caso de se optar pela articulação do ensino de outras técnicas com a CCD, e poderá ser realizado em uma ou duas aulas anteriores, onde deverão ser abordadas as teorias do arraste a vapor e da extração líquido-líquido.

Dois limões são descascados de modo a não permitir a presença de bagaço e suco nas cascas. Em um balão de 250 mL são colocadas as cascas dos limões e água é adicionada até o volume final aproximado de 125 mL. Através de uma aparelhagem de destilação simples, adap­tada com funil de adição com água, efetua-se o arraste a vapor como codestilação. Destila-se até obter um volume total de aproximadamente 300 mL de destilado. Para cada 100 mL de destilado, realiza-se extração com 15 mL de diclorometano, por cinco vezes (podendo ser utilizado acetato de etila como alternativa). As fases orgânicas são juntadas e, após secagem com sulfato de magnésio anidro e filtração, a solução final é concentrada em um evaporador rotativo, obtendo-se cerca de 1 mL de óleo, ao qual são adicionados 5 mL de diclorometano, obtendo-se assim o extrato pronto para ser aplicado nas placas cromatográficas. O óleo deve ser guardado sob-refrigeração.

Separação cromatográfica

As placas cromatográficas são preparadas cortando-se cuidado­samente, com tesoura, tiras de cromatofolha de 2 x 10 cm. Com o uso de um tubo capilar, uma gota do extrato é aplicada na parte inferior central de cada placa, a aproximadamente 0,5 cm da borda inferior. Após evaporação do solvente, as placas são submetidas à eluição em uma cuba cromatográfica com hexano. O procedimento é repetido usando-se diclorometano como eluente. Após a eluição, as placas são observadas sob luz ultravioleta de comprimentos de onda longo e curto e, em seguida, são submetidas à exposição a vapores de iodo. As placas são retiradas da câmara de iodo e assim que as manchas obtidas desaparecem das placas (reversão do complexo com iodo), elas são submetidas à revelação com solução de vanilina sulfúrica ou com solução de 2,4-DNFH. Em cada fase os fatores de retenção, Rfs, das manchas observadas são medidos.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

Separação cromatográfica

Os resultados da cromatografia do óleo das cascas de limão obtido por arraste a vapor, após revelação com os reveladores especificados, encontram-se na Tabela 1. A cromatografia do óleo obtido diretamente por ação mecânica fornece resultados semelhantes.



CONCLUSÕES

Neste trabalho foi possível demonstrar que uma experiência simples, empregando um alimento de uso cotidiano, o limão, uma fruta bem co­nhecida, pode ser usada com bons resultados no ensino da cromatografia em camada delgada (CCD). O uso de dois eluentes e cinco sistemas de revelação diferentes possibilitou a separação dos constituintes do óleo de limão em diversas frações, de acordo com as características estruturais das substâncias presentes. Com esta experiência, os alunos de uma turma da UFF foram apresentados, ao mesmo tempo e de forma articulada, aos princípios da CCD, tendo sido observado que o aprendizado pelos alunos foi mais rápido e consistente do que anteriormente verificado com outras experiências. O ensino de CCD, como descrito na aula proposta, também pode ser combinado com o ensino de outras técnicas, tais como destilação por arraste a vapor e extração líquido-líquido.

Fonte: Quim. Nova, Vol. 32, No. 8, 2234-2237, 2009
Postado por: Thamiris Montenegro

quarta-feira, 21 de maio de 2014

EXTRAÇÃO E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS DE PIMENTÕES

Experimento cadastrado por Débora Martins em 10/06/2013
 Classificação • • • • •

Introdução
O experimento mostra o processo utilizado para extrair pigmentos de pimentões de diferentes cores, com posterior separação dos pigmentos através da técnica de cromatográfica em camada delgada – CCD.O processo de separação por CCD está fundamentado na diferença de velocidade com que uma substância química migra através de um material adsorvente (fase estacionária) quando arrastada por um solvente ou uma mistura de solventes (fase móvel). O experimento pode ser utilizado para discutir conceitos tais como polaridade e interações intermoleculares.
1 Extração e análise cromatográfica de pigmentos de pimentões

Passo 1
Pesagem do material
Picar os pimentões (verde, vermelho e amarelo) em pequenos pedaços e pesar cerca de 30g de cada um.




Passo 2
Maceração dos pimentões
Colocar os pedaços, separadamente, em béqueres e adicionar 10 mL de acetona e 50 mL de hexano. Transferir as misturas para gral de porcelana e macerar os pedaços com auxilio de um pistilo. Após macerar deixar em repouso por 1 hora.

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Passo 3
Filtragem
Filtrar a mistura em funil simples com papel de filtro.




Passo 4
Separação da fase aquosa
Colocar o filtrado em funil de separação para separar as fases aquosas.




Passo 5
Adição de sulfato de sódio anidro e filtração
Adicionar a fase orgânica sulfato de sódio anidro e Filtrar a mistura utilizando funil simples.



Passo 6
Reduzir o volume da fase orgânica
Aquecer a fase orgânica em banho-maria, mantido sob agitação, até reduzir o volume da solução para 1 mL.


Passo 7
Processo de aplicação
Aplicar as amostras, utilizando capilar de vidro, em uma das extremidades de uma placa de vidro revestida com uma camada fina de sílica.



Passo 8
Processo de eluição
Preparar a cuba cromatográfica, recipiente cilíndrico com tampa, para o processo de eluição, para isso adicione uma mistura de hexano com 20% de acetona e deixe por alguns minutos para que a atmosfera interna da cuba sature com vapores da fase móvel.
Coloque a cromatoplaca no interior da cuba e retire quando a mistura de solventes estiver a cerca de 1 cm da extremidade oposta a aplicação das amostras.



Passo 9
Uso do revelador
Após a eluição a cromatoplaca foi colocada em um recipiente contendo cristais de iodo resultando em manchas marrons.



Passo 10
O que acontece
O processo de extração dos pigmentos dos pimentões utilizando uma mistura de hexano e acetona promove a extração de substâncias químicas através da formação de interações favoráveis entre essas substâncias e a mistura de solventes orgânicos formando o que chamamos de extrato.
Os extratos foram analisados utilizando a técnica de cromatografia em camada delgada. Para isso as amostras, a serem analisadas, foram aplicadas em uma das extremidades de uma placa de vidro revestida com uma camada fina de um material adsorvente altamente poroso de caráter polar, a sílica, que constitui a fase estacionária. A cromatoplaca foi eluida utilizando como fase móvel uma mistura de hexano e acetona.
O processo de separação está relacionado à maneira diferenciada com que as substâncias, que compõe a amostra, estabelecem interações favoráveis seja com a fase móvel ou com a fase estacionária. As substâncias mais polares tentem a estabelecer interações mais favoráveis com a sílica que é mais polar que os solventes orgânicos por esse motivo elas deslocam menos sobre a cromatoplaca e permanecem mais retidas, ou seja, mais próximas ao ponto de aplicação da amostra.
Já as substâncias menos polares fazem interações mais favoráveis com a mistura de solventes orgânicos, por isso percorrem maiores distâncias na cromatoplaca.
Após a eluição nem sempre observamos a presença de manchas na placa. Quando as substâncias são coloridas fica mais fácil observar a separação, porém algumas podem estar em baixas concentrações, serem incolores ou invisíveis à luz branca o que dificulta sua visualização. Para tornar essas substâncias visíveis utilizamos um revelador especifico.
Em nosso experimento colocamos a cromatoplaca exposta a vapores de iodo em um recipiente fechado resultando em manchas marrons. Isso corre porque o iodo se uniu fisicamente às substâncias, complexando com compostos insaturados presentes na cromatoplaca.

Referências bibliográficas:
RIBEIRO, N. M.; NUNES, C. R. Análise de pigmentos de pimentões por cromatografia em papel. Química Nova na Escola. n.
29, p. 34-37. 2008.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de cromatografia, Campinas, Editora da Unicampi, 2006.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um breve ensaio. Química Nova na Escola. n. 7, p. 21-25, 1998.



Postado por: RENATA BARBOSA RODRIGUES DE SOUSA

segunda-feira, 19 de maio de 2014

Determinação de daidzeína, genisteína e gliciteína em cápsulas de isoflavonas por cromatografi a em camada delgada (CCD).

Isabela da Costa César, Fernão Castro Braga, Cristina Duarte Vianna-Soares, Elzíria de Aguiar Nunan, Thiago Assis Franco Barbosa, Ligia Maria Moreira-Campos

Introdução

A cromatografi a em camada delgada (CCD) em sílica gel é uma das técnicas mais utilizadas para a separação e identifi cação de produtos naturais (Moffat, 1986; Julião et al., 2003; Valente et al., 2006), sendo amplamente empregada para o controle de qualidade analítico de matérias-primas vegetais e fi toterápicos (Budel et al., 2004; Sousa et al., 2007). Embora sejam descritos, na literatura, alguns métodos por CCD para análise de isofl avonas (Mabry et al., 1970; Harbone et al., 1975; Wagner; Blat, 1996), não foram encontradas condições detalhadas para a obtenção de perfi s cromatográfi cos visando a identifi cação de glicosídeos e agliconas de isofl avonas, em matérias-primas vegetais (extratos de isofl avonas) ou produtos acabados.
No presente trabalho são apresentadas condições de separação por CCD para identificar glicosídeos e agliconas de isoflavonas, permitindo monitorar o processo de hidrólise de extratos secos de soja.




Condições cromatográficas para análise por CCD

As análises por CCD foram realizadas em cromatofolhas de alumínio TLC de sílica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha). Aplicaram-se nas placas alíquotas de 10μL de solução etanólica contendo 0,5 mg/mL de cada um dos padrões (genisteína, daidzeína e gliciteína), e 10μL de solução metanólica de cada amostra de extrato seco de isoavonas (MP1, MP2 e MP3) a 5 mg/mL, antes e após hidrólise ácida. Foram desenvolvidos dois sistemas eluentes. O sistema A, constituído de mistura de acetato de etila e clorofórmio (70:30), foi utilizado para a separação das agliconas. O sistema B, utilizado para a separação dos glicosídeos, era constituído de uma mistura de acetato de etila, metanol e água (75:13, 75:11,25). Os cromatogramas foram desenvolvidos em cubas saturadas. A visualização das manchas correspondentes aos glicosídeos e agliconas foi feita com auxílio de luz ultavioleta, a 254 nm, em câmara ultravioleta Spectroline CM-10. O Rf correspondente a cada isoflavona foi calculado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Inicialmente, foram obtidos vários perfis cromatográficos por CCD em sílica gel, empregando condições descritas na literatura para isoflavonas (Mabry et al., 1970; Harbone et al., 1975; Wagner; Blat, 1996). A grande diferença de polaridade entre glicosídeos e agliconas dificultou a obtenção de uma condição cromatográfica única para separação de todas as formas de isoflavonas presentes em extratos secos de soja. Dessa forma, foram propostos e otimizados dois sistemas eluentes distintos, sendo um para separação e identifi cação de agliconas e outro para os glicosídeos.  A Figura 2 apresenta, de forma esquemática, os perfi s cromatográfi cos obtidos por CCD nos dois sistemas eluentes empregados (A e B) e os valores de Rf para os padrões das isoflavonas e para as três amostras de extratos secos, antes e após hidrólise. No perfil cromatográfico (Figura 2-A) obtido com o eluente acetato de etila e clorofórmio (70:30), para a separação das agliconas, os glicosídeos das isoflavonas não foram eluídos, devido à baixa polaridade do sistema empregado. Já com o eluente acetato de etila, metanol e água (75:13, 75:11,25), figura 2-B, houve eluição dos glicosídeos, mostrando dois componentes, com valores de Rf iguais a 0,45 e 0,51, que provavelmente referem-se aos glicosídeos da daidzeína (daidzina) e da genisteína (genistina), tendo em vista as agliconas que são formadas após hidrólise.  De acordo com os perfis cromatográficos obtidos e correspondência com os valores de Rf dos padrões, verifica-se que a amostra MP1 apresenta manchas correspondentes a genisteína e daidzeína com maiores intensidades, bem como aos glicosídeos dessas duas isoflavonas. A amostra MP2 se mostrou rica em daidzeína e daidzina, não apresentando outras isoflavonas em quantidades suficientes para detecção por CCD. Antes da hidrólise, MP3 apresentava apenas a aglicona daidzeína, porém na amostra hidrolisada foi possível identificar também gliciteína, indicando que essa isoflavona encontra-se na forma de glicosídeo na amostra não hidrolisada, que ou não foi separada pelo sistema solvente, ou não foi detectada.



CONCLUSÃO

As condições estabelecidas para análise por CCD mostraram-se adequadas para a identificação de isoflavonas no extrato seco de soja e para avaliar a eficiência da hidrólise, pelo desaparecimento, nas placas, das manchas referentes aos glicosídeos.




Fonte: Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 17(4): 616-625, Out./Dez. 2007

Postado por Thamiris Montenegro

sábado, 17 de maio de 2014

Controle de Qualidade de Medicamentos – Preparação de Amostras para Cromatografia em Camada Delgada



As soluções que serão aplicadas na placa devem estar suficientemente concentradas, para que o analito possa ser detectado, e puras, para que o analito seja separado como manchas compactas e discretas. O solvente no qual a amostra se encontra deve ser adequado em termos de volatilidade, viscosidade, habilidade de molhar a fase estacionária. Como a placa não é reutilizada, podem ser aplicadas soluções menos puras do que as usadas em cromatografia gasosa ou líquida de alta eficiência, desde que as impurezas não afetem adversamente a detecção (SHERMA, 2005).
O controle de qualidade de princípios ativos geralmente utiliza procedimentos simples de extração. A principal razão de fazer uma extração é remover materiais que possam interferir na análise. Mas mesmo que haja um problema de interferência após a extração, a cromatografia é capaz de separar o princípio ativo de interferentes (WATSON, 1999).
Alguns medicamentos precisam de procedimentos bem simples de preparação para análise em CCD. Na monografia de cloridrato de ciprofloxacino (solução oftálmica), o medicamento pode ser diretamente aplicado à placa. Na monografia de amoxicilina em cápsula (Farmacopéia Brasileira, 2000), é suficiente uma diluição da quantidade desejada do pó de medicamento em solução de ácido clorídrido, auxiliada por ultra-som. Na monografia de cefalexina na forma de pó para suspensão oral (The United States Pharmacopeia, 2006), basta diluir uma quantidade definida de amostra reconstituída com água.
Alguns medicamentos na forma de comprimido, como o Ibuprofeno e Carbamazepina (Farmacopéia Brasileira, 2000; Farmacopéia Brasileira, 2001), exigem sucessivas extrações em funil de separação (com clorofórmio, no caso destes princípios ativos), seguidas de filtração. Entretanto, antes da aplicação da solução teste na placa de CCD, os extratos têm que ser evaporados e diluídos em volume definido de solvente, de forma que o analito esteja suficientemente concentrado para ser detectado.
Entre os procedimentos de cleanup incluem-se extração líquido-líquido, cromatografia em coluna, extração por fluido-supercrítico, desproteinização (SHERMA, 2005). A extração líquido-líquido é uma técnica versátil de separação, na qual dois solventes imiscíveis entre si são colocados em contato e um eles possui um ou mais solutos passíveis de migrarem entre os solventes. Esta técnica pode ser efetuada em um funil de separação (KAR, 2005).
Após n extrações usando idênticos volumes V1, a fração não extraída de soluto é dada por (KAR, 2005):
f_{n}=\left (\displaystyle\frac{V_{1}}{V_{2}}K_{p}+1 \right )^{-n}
Em que V2 é o volume do solvente que continha inicialmente todo o soluto e Kp é o coeficiente de partição, dado pela razão entre a solubilidade do soluto no solvente de volume V1 e a solubilidade do solvente de volume V2. Esta equação mostra porque várias extrações são mais eficientes do que uma única extração usando o mesmo volume total de solvente.
A extração líquido-líquido está presente na farmacopéia brasileira: limite de produto de degradação da trimetoprima – Sulfametoxazol+Trimetoprima suspensão oral (Farmacopéia Brasileira, 2003):
a)    Amostra de medicamento é colocada em um funil de separação.
b)    Em seguida, são feitas três extrações com uma mistura de clorofórmio e metanol.
c)    Após evaporar a solução, o analito é dissolvido para uma concentração definida.
d)    O método de análise é a cromatografia em camada delgada, com uso de padrão de trimetoprima.
Outro caso de extração líquido-líquido apóia-se nas formas ionizadas e não-ionizadas de bases e ácidos orgânicos. As bases deste método de extração são as seguintes (WATSON, 1999):
a)    Sais de bases orgânicas (forma ionizada – ex.: sulfatos e cloretos) são altamente solúveis em água. A forma de base livre (forma não-ionizada) é usualmente solúvel em meio orgânico, particularmente em solventes polares como clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol.
b)    Sais de ácidos orgânicos (forma ionizada – ex.: de sódio ou de potássio) são solúveis em água. A forma de ácido livre (forma não-ionizada) é usualmente solúvel em solventes orgânicos.
Para ilustrar este método de extração, pode-se citar a monografia de sulfametoxazol+trimetoprima injetável da Farmacopéia dos Estados Unidos, no teste A de Compostos Relacionados – Produto de degradação de trimetoprima (The United States Pharmacopeia, 2006):
a)    Porção definida de medicamento é transferida para tubo de centrífuga;
b)    Solução de ácido clorídrico é adicionada, levando a uma precipitação de um pó branco (sal de trimetoprima – afinidade com fase aquosa);
c)    Clorofórmio é adicionado ao tubo (remoção de impurezas);
d)    Após centrifugação e remoção da fase aquosa para um funil de separação, mais solução de ácido clorídrico é adicionada ao tubo de centrífuga (segunda extração);
e)    Após centrifugação, a fase aquosa é colocada no funil de separação e o clorofórmio é descartado;
f)      A solução do funil de separação é tornada básica com utilização de solução concentrada de hidróxido de sódio (transformação da trimetoprima em sua forma de base livre);
g)    São feitas três extrações com clorofórmio (pois a trimetoprima em forma de base livre terá afinidade com este solvente);
h)    O clorofórmio é evaporado. O analito é dissolvido para uma concentração definida com uma mistura de clorofórmio e metanol.
i)      O método de análise é a cromatografia em camada delgada. A solução teste é confrontada com soluções de padrão de trimetoprima.
            Referências      
                FARMACOPÉIA Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2000. pt. 2. n. 2. POSTADO POR HELCIO SAMPAIO.

quarta-feira, 14 de maio de 2014

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Separação de pigmentos de folhas verdes por Cromatografia em Camada Delgada de Sílica Gel (CCD)
Introdução Teórica



A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. É uma técnica versátil e de grande aplicação, pois possui uma variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias.

(... )separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.

Objetivo


Entender a preparação do extrato;
Aprender a aplicar a amostra na placa de sílica gel;
Aprender sobre Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e seus cálculos de Rf (Fator de Retenção);
Identificar as substâncias no cromatograma.


Material e Reagentes

Procedimento Experimental

Preparação do extrato

Colocar em um almofariz 5-10 folhas de espinafre e alguns mililitros de uma mistura de 2:1 de éter de petróleo (fração de p.e 80-100ºC) ou hexano e etanol. Triturar bem as folhas. Utilizando uma pipeta de Pasteur e uma bolinha de algodão, filtrar o extrato, transferindo-o para um funil de separação. Adicionar o mesmo volume d água. Girar lentamente o funil, pois a agitação brusca pode causar a formação de emulsão (um colóide no qual pequenas partículas de um líquido são dispersas em outro líquido). Separar e descartar a fase aquosa. Repetir esta operação de lavagem por mais duas vezes, sempre descartando a fase aquosa. Transferir a solução de pigmentos para um Erlenmeyer e adicionar aproximadamente 2g de sulfato de sódio anidro. Após alguns minutos, utilizando a pipeta de Pasteur, decantar a solução de pigmentos do sulfato de sódio, transferindo para um béquer. Se a solução não estiver fortemente colorida de verde escuro, concentrar parte do éter de petróleo usando uma suave corrente de ar.
Aplicação da amostra na placa
Utilizando um capilar, foram aplicadas sete porções da solução de pigmentos sobre uma placa de sílica (2,5 x 7,5) a 1,0cm de cada extremidade. Evitar a difusão da mancha de forma que seu diâmetro não deva ultrapassar a 2 mm durante a aplicação da amostra. Deixar o solvente evaporar.


Desenvolvimento do cromatograma


Preparar um cuba colocando uma tira de papel de filtro de 4,0 x 5,0 cm e 5 mL de clorofórmio. Esperar o tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Colocar a placa na cuba, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente. Quando o solvente atingir a outra marca de 1,0 cm no topo da placa, remover a placa e colocar na estufa para secar por aproximadamente 3 minutos. Observar o número de manchar coloridas. Marcar a distância entre o ponto de aplicação do extrato e a frente do solvente, além da distância percorrida por cada substância, iniciando pelo ponto de aplicação até o centro de maior concentração da mancha.
As cores laranja são carotenos, as amarelas são xantofilas e azul esverdeada e verde são clorofila a e b, consecutivamente.
Para calcular o fator de retenção (Rf) mede-se a distância de uma linha à outra para encontrar o valor de X, em seguida, marca-se a distância de cada mancha colorida até a linha inicial e divide-se pelo valor de X. Observe a fórmula: Rf A = a/x ; Rf B = b/x ; Rf C .

Resultado


Após aplicação do extrato na placa de sílica gel e a introdução do material no béquer com SOMENTE clorofórmio, o líquido foi absorvido rapidamente, porém após 20 minutos a absorção ficou cada vez mais lenta e a mancha só pode ser arrastada conforme houve o isolamento da entrada de ar (o béquer foi tampado com papel ofício) e, então, a mancha foi arrastada até a linha superior da placa de sílica gel concluindo a reação e em seguida foi levada à estufa. Após seca, foram marcadas as manchas e a terceira de cima para baixo só foi possível ser localizada através do UV.
Cálculo de Fator de Retenção (Rf) só pode ter sido calculado devido à marcação das cores:
X = 4,8


Conclusão

Em relação ao extrato da folha, não houve muito entendimento de como foi sua preparação, pois o experimento da cromatografia foi feito com o extrato já preparado por outras mãos. Entretanto, a aplicação da amostra (extrato) na placa de sílica gel foi bem sucedida.
Foi observado que somente com a utilização de clorofórmio, sem ter a acetona em participação conjunta, além de fazer com que o processo de dispersão das manchas coloridas se torne mais lento, o resultado só será obtido satisfatoriamente se houver o isolamento de ar com a solução.
É importante a visualização em raios UV para que possamos observar todas as manchas coloridas, inclusive as que não são possíveis enxergar a olho nu e, assim, o cálculo de Rf terá um resultado adequado.
Neste experimento observamos a clorofila b, xantofilas e carotenos, pois só houve o aparecimento das cores verde, laranja e amarela. Ou seja, no extrato de espinafre analisado, não havia a clorofila B ou não pode ser analisado devido ao fato de só o clorofórmio ter sido utilizado.


Bibliografia

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 6ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1995.
CHAVES, M.H.; Análise de extratos de plantas por CCD: uma metodologia aplicada à disciplina Química Orgância . Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, 1997.
ROBERTS, R.M.; GILBERT, J.C.; RODEWALD, L.B.; WINGROVE, A.S., Modern experimental organic chemistry, 4th ed, Philadelphia Saunders College Publishing, 1985.
DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C., Química Nova na Escola, 1998.
Centro Universitário Estadual da Zona Oeste
Separação de pigmentos de folhas verdes por Cromatografia em Camada Delgada de Sílica Gel (CCD)


Postado por Renata Barbosa Rodrigues