Solange Leite Moraes e Maria Olímpia Oliveira Rezende
Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, CP 780, 13560-970 São Carlos - SP
Lia Emi Nakagawa e Luiz Carlos Luchini
Instituto Biológico de São Paulo, Av. Cons. Rodrigues Alves, 1252, São Paulo - SP
*e-mail: mrezende@iqsc.sc.usp.br
Recebido em 31/10/00; aceito em 6/9/01
ANALYSIS OF RESIDUE PESTICIDE IN TOMATOES BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY.
Pesticide residues are determined by thin layer chromatography (TLC)
using the Hill reaction as a detection method. Tomatoes samples
without pesticide were fortified with atrazine, diuron, chloroxuron
and metribuzin, and were applyed in silica gel plates with the help
of a microsyringe. The pesticides were elued with ethyl acetate.
There was no need of cleaning up because no interference was noticed.
After the revelation of the plates, the diameters of the spots were
measure by using a rule. The range of the determined concentration for
all the pesticides was from 0.1 to1.0 ng/mL.
The results obtained through TLC can be used for semi-quantitative
analysis.The results obtained were compared to gas and liquid
chromatography, showing good agreement between both techniques.
Keywords: tomatoes; Hill reaction; thin layer chromatography.
INTRODUÇÃO
Devido
aos riscos que os resíduos de pesticidas trazem à saúde de quem
consome alimentos contaminados com eles, há necessidade de um
monitoramento constante dos níveis de resíduos dos mesmos nos mais
variados produtos1.
Instituições com laboratórios
capazes de analisar resíduos de pesticidas são escassas em muitas
regiões e totalmente ausentes em outras. Isto porque os métodos
analíticos usualmente empregados nestas análises, que são os
cromatográficos, requerem equipamentos sofisticados e pessoal técnico
especializado. Além disso, essas técnicas demandam dos laboratórios de
resíduos grande investimento em infra-estrutura e materiais nem sempre
acessíveis2.
Assim, devido ao alto custo das
análises, necessidade de pessoal especializado e sofisticação dos
métodos empregados, a elevação do número de amostras a serem analisadas
não pode ser feita na justa medida da demanda. Conseqüentemente, a
busca de novos métodos para monitorar resíduos de pesticidas deve ser
estimulada tanto sob o ponto de vista ambiental como o de saúde
pública3,4. Desta forma, neste trabalho pretendeu-se
desenvolver uma metodologia simples e de baixo custo, sem a necessidade
de equipamentos sofisticados e de fácil aplicação local, isto é, nas
próprias regiões produtoras e distribuidoras de frutas e legumes por
exemplo, podendo-se, assim, ampliar o monitoramento e controlar a
qualidade desses produtos nas principais regiões agrícolas do Brasil.
A cromatografia em camada delgada (TLC) foi a metodologia
escolhida e desenvolvida neste estudo para a determinação dos resíduos.
As vantagens desse método são a simplicidade, a instrumentação de
baixo custo e a versatilidade, apresentando-se, portanto, adequado à
execução de determinações em série. Além disso, a TLC pode ser usada
quando as possibilidades de aplicação de outros métodos são limitadas
pelas propriedades da amostra, como por exemplo, substâncias
termolábeis, baixa volatilidade ou presença de quantidades
consideráveis de impurezas dificultando a análise (resinas, pigmentos,
etc.)5-7. O sucesso da separação cromatográfica depende do
método de detecção. Substâncias coloridas são, é claro, visíveis como
manchas distintas ao fim da corrida. Uma das maiores vantagens da TLC é
a grande variedade de reagentes de detecção usados, os quais podem ser
mais ou menos seletivos. Quando o reagente dissolvido no solvente
adequado é aplicado na placa, produz-se uma mancha colorida in situ.
O reagente pode ser classificado como não específico se produzir
manchas coloridas com uma variedade de compostos, ou específico se for
somente reativo com compostos contendo um grupo funcional particular5,8.
O
método mais comum para análises quantitativas em TLC utiliza
densitômetros contudo, existem vários outros métodos de detecção muito
sensíveis que também podem ser utilizados com esta finalidade como, por
exemplo, a reação de Hill. Esta reação faz parte do processo de
fotossíntese das plantas. Cerca de 40% dos herbicidas (uracilas,
feniluréias e triazinas, dentre outros) destroem as ervas daninhas
devido à capacidade que possuem em interferir com o processo
fotossintético.
A reação 2H2O + 2A ® 2AH2
+ O é conhecida como reação de Hill. No esquema, A representa um
aceptor artificial de hidrogênio, em sua forma oxidada e AH2 representa um aceptor
artificial de hidrogênio, em sua forma reduzida. O aceptor utilizado
por Hill foi o 2,6-diclorofenolindolfenol, um corante não biológico
que na sua forma oxidada (A) é azul e na forma reduzida (AH2) é incolor 9.
Além
desse processo, existem outros processos químicos e biológicos que são
responsáveis pela detecção de resíduos de pesticidas em TLC e a maior
ou menor sensibilidade e seletividade desses compostos vão depender da
capacidade que os mesmos possuem de inibir determinadas reações
químicas ou biológicas10. A literatura apresenta vários exemplos desses métodos capazes de detectar pesticidas na ordem de nanogramas11-21. Compostos organoclorados, fenoxiácidos e triazinas podem ser detectados com nitrato de prata16. Inseticidas organofosforados e carbamatos podem ser detectados por reações enzimáticas15,19. Herbicidas triazínicos e derivados de uréia, por inibição da fotossíntese21.
Similarmente
às outras técnicas cromatográficas, a identificação das substâncias é
também contestável em TLC, já que compostos diferentes podem apresentar
o mesmo valor de Rf. Além disso, são necessários padrões puros para
identificar compostos desconhecidos. Teoricamente, seriam necessários
reagentes específicos para cada identificação. O uso combinado de
vários reagentes de detecção ajuda na identificação de tipos ou classes
de compostos, mas não na identificação do composto individual. A única
solução para a identificação é o uso combinado de técnicas5-7.
A
tomaticultura, apesar de ser uma cultura rentável, costuma atravessar
fases críticas devido à ocorrência freqüente e constante de pragas
durante todo o ciclo da planta. Face à rápida proliferação de pragas,
os agricultores realizam aplicações preventivas de pesticidas até duas
vezes por semana, o que além de aumentar o custo da produção pode
induzir resistência às pragas22,23.
Este estudo
foi realizado com o intuito de investigar a possibilidade de aplicação
do método de cromatografia em camada delgada (TLC) em combinação
com métodos de extração e "clean-up" para análise de resíduos de
pesticidas em amostras de tomate, devido aos riscos que os resíduos
de pesticidas trazem à saúde de quem os consome e frente à
necessidade de um monitoramento constante dos níveis de resíduos.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes e Soluções
Todos
os padrões de pesticidas, atrazina, cloroxuron, diuron e metribuzin,
foram fornecidos pela Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA)
com pureza superior a 99%. As soluções estoque, na concentração de
1mg/mL cada, foram preparadas em acetona e as soluções trabalho foram
preparadas por diluição da solução estoque. Bio-beads SX3 (200-400
mesh) foram usadas como gel para cromatografia de permeação em gel
(GPC). O solvente acetato de etila e as placas de sílica gel 60F de
(20x20) cm2 foram adquiridas da Merck. A Figura 1 apresenta os herbicidas estudados.
As
placas cromatográficas foram ativadas a 105 °C durante 1 hora. As
cubas foram saturadas durante 30 minutos, antes de sua utilização.
Para a aplicação dos padrões de pesticidas utilizou-se microsseringa
de 25 mL.
A quantidade mínima
detectada (MDQ) foi determinada diminuindo-se gradativamente a
quantidade do composto aplicada até se obter a menor quantidade
claramente visível como mancha na placa.
Os valores de Rf
foram determinados em cubas de desenvolvimento mantidas em salas a 20
°C. O eluente ficou em equilíbrio com a fase vapor pela inserção de um
papel de filtro na cuba de desenvolvimento, durante 30 minutos. Após o
desenvolvimento das placas, estas foram secas e reveladas.
A Figura 2 ilustra como foram aplicadas as soluções de pesticidas para determinação em TLC.
Inibição da fotossíntese [reação de Hill] 3
O
método de detecção utilizado neste trabalho foi o método de inibição
da fotossíntese. Este método é específico para compostos que atuam na
inibição da fotossíntese.
Plantaram-se sementes de trigo em
potes que foram colocados próximos à janela. Em solos de boa qualidade,
as folhas de trigo podem ser colhidas em duas semanas. Após esse
período, 30g de folhas de trigo foram cortadas e colocadas em um
cadinho de porcelana, acrescentando-se 3 mL de glicerina, 15 mL de água
destilada e 5g de areia. A mistura, após macerada até homogeneidade,
foi filtrada em um béquer em quatro camadas de gaze. Deve-se cobrir o
béquer contendo o extrato das folhas com papel alumínio e mantê-lo em
geladeira até o momento da determinação, que não deve ultrapassar 12
horas.
A solução tampão bórax foi preparada pela adição de
350 mL de solução 0,05 mol/L de bórax a 150 mL de HCl 0,1 mol/L. A
solução de 2,6 - diclorofenolindolfenol de sódio (DCPIP) foi preparada
misturando-se 200 mg de 2,6 - diclorofenolindolfenol de sódio a 500 mL de tampão bórax.
A solução reagente foi preparada adicionando-se 20 mL do extrato das folhas a 10 mL da solução de DCPIP.
A
revelação foi feita borrifando-se a placa com a solução reagente e
expondo-a à lâmpada de 60W a uma distância de 20 cm. Em aproximadamente
3 minutos manchas azuis apareceram na placa de fundo esverdeado.
Determinação das curvas analíticas em TLC
Para
a elaboração das curvas analíticas por TLC, utilizaram-se 5
concentrações padrão (MDQ, 2xMDQ, 4xMDQ, 6xMDQ e 8xMDQ, para cada
pesticida), em acetona. As soluções padrão foram aplicadas entre 5-25
µL, com manchas que produziram entre 3-4 mm de diâmetro.
Após o desenvolvimento da placa, mediram-se os diâmetros (1 e 2) da mancha e calculou-se a média, conforme ilustra a Figura 3.
Todas as medidas foram realizadas em triplicata. Construíram-se
gráficos com a média dos diâmetros, Dm, em mm, em função da
quantidade do composto aplicada (ng).
Determinação das curvas analíticas em GC e HPLC
Para
a determinação das curvas analíticas em GC e HPLC novas soluções
padrão foram preparadas em metanol na concentração de 100 mg/L. A
partir dessa solução estoque fizeram-se as diluições nas mesmas
concentrações utilizadas na determinação das curvas analíticas em TLC.
Para a determinação cromatográfica dos compostos atrazina,
diuron, cloroxuron e metribuzin utilizou-se um cromatógrafo a gás com
detector de captura de elétrons e injetor split, Hewlett Packard 5890,
série II, operando sob as seguintes condições: coluna Ultra 2 (5% fenil
metil siliconada) 25 m x 0,2 mm x 0,33 µm; temperatura do forno (180
°C); temperatura do injetor (270 °C); temperatura do detector (320 °C);
volume de injeção 1 µL; modo split (1: 13); gás de arraste hidrogênio
1mL min-1 ; gás auxiliar nitrogênio 1mL min-1;
com programação da rampa de temperatura sendo temperatura inicial de
180 °C por 2,5 min, seguida do incremento de 3 °C/min por 1 min
e de 10 °C/min até 280 °C.
As determinações cromatográficas
para o herbicida cloroxuron foram feitas utilizando um cromatógrafo
líquido SHIMADZU com bombas LS-10AD acoplado a um detector SPD-M6A com
arranjo de diodos, UV-Vis. Utilizou-se uma coluna: C-18, com 30 cm de
comprimento e 4 mm de diâmetro interno. As condições analíticas foram:
água/metanol (20-80 v/v) como eluente, razão de fluxo 1 mL/min; volume
de injeção: 20 µL ("loop") e detecção em 254 nm.
Condições cromatográficas para o "clean-up"
O
processo de "clean-up"utilizado neste estudo foi a cromatografia de
permeação em gel (GPC), sistema semi-automático KL-SX-3, operando com
pressão de nitrogênio de 0,4 bar. Utilizou-se uma coluna de vidro, 10
mm id x 20 cm, empacotada com Bio-Beads SX-3, 200-400 mesh. O sistema
de eluição foi acetato de etila/cicloexano (1:1 v/v); utilizando-se
nitrogênio como gás de arraste. A razão do fluxo foi de 1mL/min.
O
gel utilizado para preencher a coluna foi misturado sob agitação com
acetato de etila e cicloexano (1:1 v/v) durante 5 horas em mesa
agitadora.
Primeiramente, realizou-se a calibração da coluna
de permeação em gel com o intuito de descobrir quais eram as frações
em que os pesticidas estudados e o pigmento natural do tomate eluíam.
Definição das frações de eluição do pigmento
Amostras
de tomates (em triplicata) isentas de pesticidas foram injetadas em
GPC, após o processo de extração. Injetou-se 0,5 mL do extrato (branco)
e coletaram-se 30 frações de 1 mL cada. As frações coletadas foram
determinadas em um espectrofotômetro de absorção HITACHI, modelo
U-1100, operando em 470 nm, comprimento de onda em que ocorre o máximo
de absorção para o pigmento vermelho do tomate.
Definição das frações de eluição para os pesticidas
Os
extratos de tomates (testemunhas) foram fortificados com pesticidas
radiomarcados na concentração de 180.000 dpm e, após o processo de
extração, foram injetadas em GPC. Injetou-se 0,5 mL do extrato e
coletaram-se 30 frações de 1 mL cada. As frações coletadas foram
analisadas em um espectrofotômetro de cintilação líquida, após a adição
de 7 mL da solução de 0,4 g de POP (2,5 difeniloxazole), 0,2g de POPOP
(1,4 bis 2-(5-difeniloxazole)-benzeno) e 1340 mL de tolueno e 660 mL
de renex25. Os pesticidas radiomarcados foram: 14C-atrazina e 14C-diuron,
representando as classes dos pesticidas s-triazinas e uréia,
respectivamente. Determinou-se a recuperação dos pesticidas após a
passagem pela coluna cromatográfica.
Os
tomates foram adquiridos em lojas de produtos orgânicos, denominação
esta dada aos alimentos supostamente sem pesticidas. Esses tomates
foram analisados de acordo com a metodologia aqui desenvolvida, não
sendo constatada a presença de pesticidas neles.
As amostras de tomate foram extraídas segundo o procedimento esquematizado na Figura 4.
A quantidade de pesticida adicionada em cada amostra foi 1,0 µg de
atrazina, 1,0 µg cloroxuron, 1,0 µg diuron e 0,50 µg de metribuzin,
considerando 60 g de amostra. Após a extração, as amostras foram
submetidas a um processo de "clean-up" em cromatografia de permeação
em gel, para remoção dos interferentes e os pesticidas adicionados
foram determinados por TLC, com o objetivo de avaliar a recuperação
do método.
Injetou-se
0,5 mL do extrato fortificado em GPC e as frações correspondentes ao
pigmento foram descartadas. As demais frações de 14 a 30 foram
coletadas, concentradas em rotaevaporador e ressuspendidas em 0,5 mL de
acetona para aplicação nas placas de TLC. As frações contendo os
pesticidas foram determinadas anteriormente por procedimento semelhante
usando-se apenas pesticidas radiomarcados. As mesmas amostras (após
mudança de solvente para metanol) foram determinadas por cromatografia
gasosa (GC) e por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para
confirmação dos resultados de recuperação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todos os padrões de herbicidas utilizados neste trabalho foram testados usando o método de detecção reação de Hill.
Após
a revelação da placa as cores dos pesticidas são nitidamente visíveis.
As cores obtidas para cada pesticida dependem do método de detecção
utilizado. Para o método de detecção reação de Hill as manchas
apresentaram colorido azul.
O RRfatrazina é
definido como o Rf do pesticida em relação ao pesticida atrazina. É
medido através do Rf pesticida/Rf atrazina sendo ambos aplicados na
mesma placa, de forma que os possíveis interferentes sejam
compensados. Assim, os valores de Rf de todos os pesticidas são
calculados em relação a um único parâmetro: o Rf da atrazina. Os
valores de RRfatrazina foram determinados segundo a equação:
Na Tabela 1 apresentam-se os valores de Rf, os valores de Rf com relação à atrazina (RRfatrazina) para o sistema de eluição acetato de etila e a MDQ. Com
base nos resultados, os valores de RRf são mais precisos para
identificação do composto do que os valores de Rf, uma vez que os
valores de Rf divergem muito de um laboratório para outro. A MDQ de
um pesticida é definida como sendo a quantidade do padrão analítico,
expressa em nanogramas, que produz manchas claramente visíveis na
placa3. Portanto, quanto menores os valores da MDQ, maior é a sensibilidade do método para o pesticida.
Como
o método de detecção reação de Hill é um método específico, para
compostos que podem atuar na inibição da fotossíntese, todos os
herbicidas utilizados neste trabalho foram detectados, uma vez que os
mesmos podem atuar no processo fotossintético.
Determinação das Curvas Analíticas em TLC
Para
a determinação das curvas analíticas, as medidas dos diâmetros da
mancha foram feitas utilizando-se régua. Deve-se, portanto, levar em
consideração os erros das medidas tais como, imprecisão da régua,
vizualização da mancha, nitidez de contorno, etc.
A Figura 5
mostra as curvas analíticas obtidas para cada pesticida no sistema
de eluição acetato de etila, método reação de Hill. O diâmetro da
mancha representa a média de triplicatas.
Testes da Eficiência do "Clean-up" em Coluna de Permeação em Gel
Para
avaliar qual era a fração de eluição do pigmento e dos pesticidas
foram determinadas as absorções das diferentes frações coletadas para
amostras de tomate isentas de pesticidas (branco). Na Figura 6 apresenta-se a absorção do extrato de tomate nas diferentes frações coletadas.
Pelas figuras verifica-se que as
frações nas quais ocorre a eluição do pigmento são as frações de número
9 a 13, ou seja, nessas frações houve maior absorção do pigmento. Esta
maior absorção pode ser visualmente observada durante as coletas das
frações devido à coloração vermelha do extrato de tomate.
Para
avaliar as frações de eluição dos pesticidas, as diferentes frações
coletadas foram determinadas em um espectrofotômetro de cintilação
líquida. Utilizaram-se pesticidas radiomarcados de diferentes classes
químicas. Na Figura 7 apresentam-se as frações nas quais os pesticidas eluem.
Pela Figura 7
verifica-se que a eluição do pesticida diuron, pertencente à classe
uréia, ocorre nas frações 13 a 19, enquanto que o pesticida atrazina,
pertencente à classe das s-triazinas, co-elui com o pigmento de
tomate nas frações entre 11 e 18. O processo de "clean-up" para o
herbicida atrazina não produz boa eficiência de separação. Pela Figura 8 visualizamos a não separação do pigmento juntamente com o herbicida, após passagem pela coluna de permeação em gel.
Teste de Recuperação dos Pesticidas Radiomarcados
Os extratos de tomates foram fortificados com os pesticidas radiomarcados. A Tabela 2 apresenta os valores de recuperação dos pesticidas após a passagem pela coluna do GPC.
Estudo Cromatográfico em GC-ECD e HPLC-UV
Para
a determinação dos tempos de retenção, determinou-se cada composto
individualmente, depois fez-se uma mistura de todos os compostos
sensíveis ao detector de captura de elétrons e traçou-se a curva
analítica.
Testou-se o pesticida cloroxuron nas condições
descritas mas não se obteve resposta para esse composto. O composto
cloroxuron foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC).
A Tabela 3
mostra os valores obtidos para elaboração das curvas analíticas e os
tempos de retenção obtidos através de um GC-ECD e HPLC.
A Tabela 4
apresenta a média do diâmetro de cada amostra antes e após o
processo de "clean-up". Para avaliar a possibilidade das amostras
serem determinadas sem o processo de "clean-up", as mesmas foram
aplicadas diretamente nas cromatoplacas após o procedimento de
extração.
Os valores apresentados na Tabela 4
para o cálculo da recuperação dos pesticidas representam um problema
sério ocasionado, principalmente, pela imprecisão das medidas. A
precisão das réguas comuns é de ±0,5 mm, logo, os erros das medidas
estão compreendidos nesta mesma faixa. Ao medir a mancha, por
exemplo, com réguas de marcas diferentes obtém-se valores diferentes
dos diâmetros da mancha e como os resultados das recuperações são
obtidos utilizando-se curvas analíticas (diâmetro da mancha versus
quantidade do composto aplicada), um erro na medida de ±0,5 mm é um
erro muito significativo, uma vez que o intervalo das medidas do
diâmetro da mancha versus quantidade do composto aplicada é muito
pequeno. Isto pode ser melhor visualizado nas curvas analíticas
apresentadas na Figura 5. Além disso, é difícil definir exatamente o contorno do diâmetro da mancha.
A Tabela 5
mostra os valores de cada determinação obtidos por GC e HPLC
considerando-se 2xLOD e 5xLOD, com a faixa de concentração obtida por
TLC.
Os valores de concentração por TLC foram apresentados na tabela
por um intervalo de valores. Estes consideram o erro na leitura do
diâmetro da mancha que no caso é de ± 0,5 mm.
Para a
quantificação dos pesticidas estudados em TLC, método de detecção
reação de Hill, não é necessário fazer o processo de "clean-up" uma vez
que não há interferência do pigmento com o analito após a revelação da
placa cromatográfica. Somente o pesticida diuron sofreu interferência
com o pigmento, tornando necessário o "clean-up" em coluna de permeação
em gel.
Nota-se, também, que por TLC não é possível
determinar o valor exato da quantidade de composto, principalmente
devido à imprecisão da medida do diâmetro da mancha.
CONCLUSÕES
Pelo
método de detecção reação de Hill os herbicidas atrazina, cloroxuron,
diuron e metribuzin foram detectados com valores de MDQ entre 0,05 e 1
ng dependendo do composto. O limite de detecção para o pesticida
metribuzin utilizando esse método de detecção foi 0,02 ng/µL, valor
inferior ao limite de resíduo permitido para o tomate que segundo a FAO
(Food and Agriculture Organization,) é 0,1 mg/kg26. Para
esse método de detecção é possível eliminar a etapa de "clean-up" uma
vez que não ocorre interferência entre o pigmento e o analito. Assim,
há uma diminuição no número de operações manuais que afetam a precisão e
exatidão nas análises de resíduos, resultando em considerável economia
de reagentes, solventes e tempo de análise.
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