As soluções que serão aplicadas na placa devem estar suficientemente concentradas,
para que o analito possa ser detectado, e puras, para que o analito seja
separado como manchas compactas e discretas. O solvente no qual a amostra se
encontra deve ser adequado em termos de volatilidade, viscosidade, habilidade
de molhar a fase estacionária. Como a placa não é reutilizada, podem ser
aplicadas soluções menos puras do que as usadas em cromatografia gasosa ou
líquida de alta eficiência, desde que as impurezas não afetem adversamente a
detecção (SHERMA, 2005).
O controle de qualidade de princípios ativos geralmente utiliza
procedimentos simples de extração. A principal razão de fazer uma extração é
remover materiais que possam interferir na análise. Mas mesmo que haja um
problema de interferência após a extração, a cromatografia é capaz de separar o
princípio ativo de interferentes (WATSON, 1999).
Alguns medicamentos precisam de procedimentos bem simples de preparação para
análise em CCD. Na monografia de cloridrato de ciprofloxacino (solução
oftálmica), o medicamento pode ser diretamente aplicado à placa. Na monografia
de amoxicilina em cápsula (Farmacopéia Brasileira, 2000), é suficiente uma
diluição da quantidade desejada do pó de medicamento em solução de ácido
clorídrido, auxiliada por ultra-som. Na monografia de cefalexina na forma de pó
para suspensão oral (The United States Pharmacopeia, 2006), basta diluir uma
quantidade definida de amostra reconstituída com água.
Alguns medicamentos na forma de comprimido, como o Ibuprofeno e
Carbamazepina (Farmacopéia Brasileira, 2000; Farmacopéia Brasileira, 2001),
exigem sucessivas extrações em funil de separação (com clorofórmio, no caso
destes princípios ativos), seguidas de filtração. Entretanto, antes da
aplicação da solução teste na placa de CCD, os extratos têm que ser evaporados
e diluídos em volume definido de solvente, de forma que o analito esteja
suficientemente concentrado para ser detectado.
Entre os procedimentos de cleanup incluem-se extração
líquido-líquido, cromatografia em coluna, extração por fluido-supercrítico,
desproteinização (SHERMA, 2005). A extração líquido-líquido é uma técnica
versátil de separação, na qual dois solventes imiscíveis entre si são colocados
em contato e um eles possui um ou mais solutos passíveis de migrarem entre os
solventes. Esta técnica pode ser efetuada em um funil de separação (KAR, 2005).
Após n extrações usando idênticos volumes V
1, a fração não
extraída de soluto é dada por (KAR, 2005):
Em que V2 é o volume do solvente que continha inicialmente todo o
soluto e Kp é o coeficiente de partição, dado pela razão entre a
solubilidade do soluto no solvente de volume V1 e a solubilidade do
solvente de volume V2. Esta equação mostra porque várias extrações
são mais eficientes do que uma única extração usando o mesmo volume total de
solvente.
A extração líquido-líquido está presente na farmacopéia brasileira: limite
de produto de degradação da trimetoprima – Sulfametoxazol+Trimetoprima
suspensão oral (Farmacopéia Brasileira, 2003):
a) Amostra de medicamento é colocada em um funil de
separação.
b) Em seguida, são feitas três extrações com uma mistura
de clorofórmio e metanol.
c) Após evaporar a solução, o analito é dissolvido para
uma concentração definida.
d) O método de análise é a cromatografia em camada
delgada, com uso de padrão de trimetoprima.
Outro caso de extração líquido-líquido apóia-se nas formas ionizadas e
não-ionizadas de bases e ácidos orgânicos. As bases deste método de extração
são as seguintes (WATSON, 1999):
a) Sais de bases orgânicas (forma ionizada – ex.: sulfatos
e cloretos) são altamente solúveis em água. A forma de base livre (forma
não-ionizada) é usualmente solúvel em meio orgânico, particularmente em
solventes polares como clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol.
b) Sais de ácidos orgânicos (forma ionizada – ex.: de
sódio ou de potássio) são solúveis em água. A forma de ácido livre (forma
não-ionizada) é usualmente solúvel em solventes orgânicos.
Para ilustrar este método de extração, pode-se citar a monografia de
sulfametoxazol+trimetoprima injetável da Farmacopéia dos Estados Unidos, no
teste A de Compostos Relacionados – Produto de degradação de trimetoprima (The
United States Pharmacopeia, 2006):
a) Porção definida de medicamento é transferida para tubo
de centrífuga;
b) Solução de ácido clorídrico é adicionada, levando a uma
precipitação de um pó branco (sal de trimetoprima – afinidade com fase aquosa);
c) Clorofórmio é adicionado ao tubo (remoção de
impurezas);
d) Após centrifugação e remoção da fase aquosa para um
funil de separação, mais solução de ácido clorídrico é adicionada ao tubo de
centrífuga (segunda extração);
e) Após centrifugação, a fase aquosa é colocada no funil
de separação e o clorofórmio é descartado;
f) A solução do funil de separação é tornada
básica com utilização de solução concentrada de hidróxido de sódio (transformação
da trimetoprima em sua forma de base livre);
g) São feitas três extrações com clorofórmio (pois a
trimetoprima em forma de base livre terá afinidade com este solvente);
h) O clorofórmio é evaporado. O analito é dissolvido para
uma concentração definida com uma mistura de clorofórmio e metanol.
i) O método de análise é a cromatografia em
camada delgada. A solução teste é confrontada com soluções de padrão de
trimetoprima.
Referências
FARMACOPÉIA
Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2000. pt. 2. n. 2. POSTADO POR HELCIO SAMPAIO.
