Existem três tipos de métodos de detecção
aplicáveis a Cromatografia em Camada Delgada (JORK, FUNK, et al., 1990):
a) Métodos Físicos: São técnicas
não-destrutivas. Incluem absorção fotométrica, inibição de fluorescência ou
fosforescência e detecção de substâncias marcadas radioativamente;
b) Reações Microquímicas: Uso de
um reagente universal ou com substâncias que reagem com um grupo funcional
específico.
c) Detecção biológico-fisiológica
(Biological-physiological detection): métodos que
dependem da atividade biológica de componentes separados, independentemente de
suas propriedades químicas ou físicas. São altamente específicos. Usados para
detecção e determinação de antibióticos, alcalóides, inseticidas, fungicidas,
micotoxinas, vitaminas e saponinas.
1 Luz Ultravioleta
O uso da luz ultravioleta é aplicável para fases
estacionárias impregnadas com material fluorescente (placas F254). Usa-se o comprimento de onda de 254 nm e, se o
analito absorve a luz, ele será visto como uma mancha preta, enquanto que o
fundo estará colorido devido ao reagente fluorescente. Se o composto é
naturalmente fluorescente, o uso do comprimento de onda de 365 nm pode ser
usado (WATSON, 1999).
2 Tratamento com Iodo
O iodo atua como um reagente universal, visto que
há exemplos de aplicação para várias classes de substâncias – ex.: aminoácidos,
indóis, alcalóides, esteróides, psicotrópicos, lipídios. O cromatograma pode
ser tratado com vapores de iodo (coloca-se a placa em uma câmara onde anteriormente
cristais de iodo foram dispersos em seu fundo, esperando que esta fique
saturada de vapores de iodo) ou pela nebulização de uma solução de iodo (JORK,
FUNK, et al., 1990).
A reação com o iodo geralmente é reversível. Caso a
opção seja vapores de iodo, deve-se documentar o cromatograma rapidamente, pois
as manchas desaparecerão quando o vapor de iodo for evaporado da placa. No
desejo de preservar as manchas, pode-se usar uma solução de amido, produzindo
manchas azuis estáveis (JORK, FUNK, et al., 1990).
Os tipos de reações que poderão ocorrer com o iodo
são (WALL, 2005):
a) Formação de produtos de
oxidação: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, indóis e derivados
quinolínicos;
b) Adição do iodo a ligações
duplas: alcalóides derivados da quinina, barbitúricos, lipídeos insaturados,
capsaicinóides e calciferol;
c) Adição a nitrogênio terciário:
opióides
d) Adição a grupo –OCH3: brucina
e) Oxidação de enxofre e adição a
dupla ligação no anel tiazólico: tióis e tioéteres;
f) Formação de
complexo: alcalóides, fenotiazinas e sulfonamidas.
Um exemplo na farmacopéia brasileira é a
identificação de Ampicilina, tanto na matéria-prima, como no produto terminado
– cápsulas, comprimidos e pó para suspensão oral (Farmacopéia Brasileira,
2000).
3 Derivatização
Os métodos físicos de detecção não são suficientes
para conferir um alto grau de precisão e acurácia (JORK, FUNK, et al., 1990). Assim, estes métodos podem ser
complementados por reações químicas específicas (derivatização). A
derivatização pode ocorrer em várias etapas:
a) Anteriormente ao
desenvolvimento cromatográfico (pré-cromatográfico): pode ser efetuada durante
a preparação da amostra ou diretamente na placa;
b) Posteriormente ao
desenvolvimento cromatográfico (pós-cromatográfico): detecção do cromatograma
em sua forma propriamente dita.
3.1 Reagente
aldeído/ácido
Baseia-se numa reação que depende da protonação de
um aldeído aromático (vanilina ou anisaldeído), que ocorre na presença de
eletrófilos. A condensação com certas moléculas orgânicas pode ocorrer
imediatamente para formar corantes do tipo trifenilmetano. A associação
vanilina/ácido sulfúrico ou vanilina/ácido clorídrico pode ser usada para
visualização de catequinas, alcalóides, flavonóides, componentes de óleos
essenciais, esteróides e fenóis (WALL, 2005). Já a associação anisaldeído/ácido
sulfúrico pode ser usada para visualizar antioxidantes, esteróides,
prostaglandinas, carboidratos, fenóis, glicosídeos, parte aglicona de
saponinas, componentes de óleos essenciais ou terpenos, antibióticos
(macrolídeos e tetraciclinas) e micotoxinas – tricotecenos (JORK, FUNK, et al., 1990).
Na farmacopéia brasileira, encontramos exemplo
deste reagente na monografia do cloridrato de propranolol – substâncias relacionadas
(Farmacopéia Brasileira, 2001). O reagente é formado por anisaldeído, ácido
acético glacial, metanol e ácido sulfúrico.
3.2 Reagente de
Dragendorff
O Reagente de Dragendorff pode ser utilizado para
visualizar a maioria, quem sabe até a totalidade, dos compostos orgânicos
nitrogenados. Consiste na preparação de duas soluções (WALL, 2005):
a) Solução A: Nitrato de Bismuto
(III) é dissolvido em ácido acético e água
b) Solução B: Iodeto de potássio
é dissolvido em água
A partir da mistura de igual proporção destas
soluções, prepara-se uma solução de estoque. A solução a ser borrifada é obtida
pela mistura da solução de estoque com ácido acético e água.
A monografia de clotrimazol creme possui um teste
de identificação que faz uso deste reagente, mas utilizando ácido clorídrico no
lugar no ácido acético (The United States Pharmacopeia, 2006). As manchas
do analito aparecem com coloração alaranjada.
3.3 Tratamento com
ninidrina
Constitui um método de derivatização que pode ser
tanto pré-cromatográfico, quanto pós-cromatográfico. A ninidrina pode ser
colocada na fase móvel com o objetivo de converter peptídios, aminoácidos ou
aminas para derivados fluorescentes ou coloridos (JORK, FUNK,et al., 1990). Aminas primárias geram manchas de cor rosa,
enquanto que as terciárias produzem cor amarela (WATSON, 1999).
Existem exemplos do uso da ninidrina em
farmacopéias. A identificação de cefalexina em suspensões orais, comprimidos e
cápsulas pode ser feita inserindo a ninidrina na fase móvel (The United States
Pharmacopeia, 2006). A ninidrina também pode ser usada em solução reveladora: a
identificação de carbidopa+levodopa em comprimidos – solução de ninidrina em
acetona (The United States Pharmacopeia, 2006) – e a identificação de
amoxicilina em cápsulas – solução de ninidrina em etanol (Farmacopéia
Brasileira, 2000).
3.4 Reagent de
Ehrlich
Detecta aminas e indóis. É uma solução de
4-dimetilaminobenzaldeído em ácido clorídrico/etanol (WALL, 2005). As
monografias de substâncias relacionadas de ibuprofeno (Farmacopéia Brasileira,
2001) e ensaio de pureza (limite de degradação de sulfametoxazol) apresentam
esta solução reveladora (Farmacopéia Brasileira, 2003).
3.5 Cloreto Férrico
Detecta fenóis, alcalóides do ergot, ânions
inorgânicos, enóis, ácidos hidroxâmicos e ésteres de colesterol. Dilui-se o
cloreto férrico em etanol ou água. Após tratamento, a placa deve ir para estufa
(WALL, 2005). Na farmacopéia brasileira, o teste de substâncias relacionadas do
ibuprofeno faz uso deste reagente (Farmacopéia Brasileira, 2001).
3.6 Regente de Jenson
Usados para detectar glicosídeos cardíacos. Formado
por mistura de Cloramina T com ácido tricloroacético em clorofórmio, metanol e
água. Após tratamento, deve ir para estufa (WALL, 2005). A monografia da
digoxina contempla o uso deste reagente (Farmacopéia Brasileira, 2002).
Postado por: Renata Barbosa Rodrigues
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